一、物化性质

保存条件：避光、-20°C储存，避免反复冻融

溶解性：可溶于有机溶剂（如DMF、DMSO）

英文名称：Calcein tetraethylester

中文名称：钙黄绿素四乙酯

CAS：1170856-93-5

分子式：C38H42N2O13

分子量：734.75

激发波长（Ex） ：489 nm

发射波长（Em） ：515 nm

荧光机制：

酯化形式（非极性）可被动穿透细胞膜；

细胞内酯酶水解乙酯基团，转化为极性荧光产物 Calcein（钙黄绿素） ，滞留胞内并发出绿色荧光。

规格：5mg、10mg、25mg

纯度：95%+

二、使用步骤详解

（一）储备液配制

溶剂选择：

首选无水DMSO（高纯度），避免使用含血清或酚红的缓冲液（会增强背景荧光）。

参考浓度：10 mM储备液（如：7.35 mg Calcein tetraethylester溶于1 ml DMSO）。

溶解技巧：

37℃水浴加热助溶，超声处理5-10分钟。

分装保存：

按单次用量分装，避免反复冻融。

储存条件：-20℃避光；未开封固体有效期2年，储备液需在1个月内使用。

（二）工作液制备

推荐浓度：2–5 μM（根据细胞类型优化，初次实验建议梯度测试）。

稀释方法：用PBS或Hanks缓冲液稀释储备液（如：2 μl 10 mM储备液 + 10 ml PBS → 2 μM工作液）。

（三）细胞染色流程

细胞准备：

贴壁细胞：弃培养基，PBS轻柔洗涤2次。

悬浮细胞：离心收集，PBS重悬。

染色孵育：

加入预热的工作液（100 μl/孔96孔板），37℃避光孵育30分钟。

可选步骤：更换新鲜培养基，继续孵育15-30分钟以增强水解。

荧光检测：

显微镜观察：直接置于荧光显微镜下（激发滤片485 nm，发射滤片515 nm）。

酶标仪定量：检测激发501 nm/发射521 nm的荧光强度（与细胞活性成正比）。

流式细胞术：细胞消化后重悬于PBS，上机分析。

三、工作原理

Calcein tetraethylester 的工作原理依赖于细胞内酶促水解转化和膜通透性差异，具体分为三步：

（一）细胞渗透性（被动扩散）

该化合物为酯化形式（四乙酯衍生物），具有非极性特性（LogP值≈6.56），能自由穿透活细胞的脂质双分子层膜。这种被动扩散不依赖能量，使其进入细胞。

（二）细胞内水解活化

进入细胞后，内源性酯酶（intracellular esterases）催化水解其乙酯基团，生成水溶性荧光产物 Calcein（钙黄绿素）。此过程不可逆，且依赖细胞代谢活性：

活细胞：酯酶活性高，水解完全，Calcein 积累于胞质；

死细胞或凋亡细胞：酯酶失活或膜完整性丧失，无法完成转化或染料泄漏。

（三）荧光产物滞留

水解后的 Calcein 含羧基（-COOH）和羟基（-OH），呈 强亲水性，无法穿透完整细胞膜，因此被长期滞留于活细胞内。死细胞因膜破损，染料迅速逸出。

四、关联试剂

Cyanine2 NHS Ester

PSMA-ICG，ICG-PSMA

AlexaFluor594 Phalloidin

Alexa Fluor 555 maleimide

4-Diethylamino-piperidine

BODIPY aminoacetaldehyde

IR780 Biotin，IR-780 Biotin

Cyanine5 NHS ester minimal dye

Sulfo-Cyanine5.5-Phenylboronic Acid

IR-808 Maleimide，IR808 Maleimide

Cyanine3-Cholesterol；花菁素CY3标记胆固醇

（本文内容由陕西新研博美生物科技有限公司木南整理）